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qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng),也叫實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng),簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR。廣泛用于特異性核酸的檢測(cè)。qPCR通常在標(biāo)準(zhǔn)的96孔板上進(jìn)行,現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里的96孔板就像移液器和燒杯那樣常見(jiàn)。
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qPCR的基本步驟
NCBI里的數(shù)據(jù),為引物設(shè)計(jì)和功能分析帶來(lái)了方便,但是這些數(shù)據(jù)都是理論上的,實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作還要經(jīng)過(guò)各種的計(jì)算。不比擔(dān)心,有心人已經(jīng)把qPCR實(shí)驗(yàn)中所用到的各種工具都“打包”了,比如Biosearch(http://www.qpcrdesign.com/oligo-toolbox)這個(gè)網(wǎng)站里,就有一個(gè)成套的qPCR工具箱Oligo Toolbox,其中包含的工具能做很多實(shí)驗(yàn)計(jì)算工作。
OligoSpec? Calculator
OligoSpec? Calculator可以確定引物或探針的特定物理性質(zhì),比如可能擁有的5',3'或內(nèi)部修飾,甚至還有熒光團(tuán)、黑洞淬滅基團(tuán)標(biāo)記、生物素標(biāo)簽或修飾堿基。如果科研人員知道序列但是不知道分子量(MW),這個(gè)計(jì)算器也能派上用場(chǎng),它還能把單位從“克”換算成“摩爾”。此外,該工具還提供了260 nm處寡聚物的消光系數(shù),可與濃度計(jì)算器一起定量濃度。
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qPCR Reaction Estimator
這個(gè)qPCR反應(yīng)估計(jì)器可以用于計(jì)算小瓶引物或探針實(shí)際上會(huì)持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)然……是理論上,也可以來(lái)預(yù)估引物的數(shù)量。輸入一些關(guān)于反應(yīng)條件的基本信息,以找出寡核苷酸可能執(zhí)行的反應(yīng)次數(shù)。不過(guò)一些液體會(huì)因?yàn)橐埔憾鴣G失,所以實(shí)際的反應(yīng)次數(shù)會(huì)少于預(yù)估值。
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Oligo Resuspension Calculator
這個(gè)有用的小工具能用來(lái)計(jì)算水或TE緩沖液的確切體積來(lái)重懸浮新加入的寡核苷酸。一些寡核苷酸廠家提供的說(shuō)明書(shū)里只會(huì)教你怎么在干粉引物里加稀釋劑來(lái)配100 μM的濃度。但缺點(diǎn)也很明顯,限制太大了,如果要準(zhǔn)備不同濃度引物,那就需要這個(gè)計(jì)算器來(lái)幫你。由于多次凍融循環(huán)會(huì)促進(jìn)寡聚體降解,因此可以考慮將您的寡核苷酸分裝成一系列工作濃度的等分試樣。
Oligo Dilution Calculator
類(lèi)似上面的工具,也是一個(gè)非常簡(jiǎn)單明了的計(jì)算器。對(duì)于數(shù)學(xué)苦手來(lái)說(shuō),qPCR中的那些多任務(wù)計(jì)算實(shí)在是有心無(wú)力,有了這個(gè)后日子就好過(guò)多了。只要輸入寡核苷酸的濃度、所需的最終濃度和體積和ta-da,它就能算出所需稀釋劑的體積。稀釋計(jì)算器還有一個(gè)有用的功能是貼心的提供了不同的單位,再也不用擔(dān)心單位從皮摩爾轉(zhuǎn)換到微摩爾的時(shí)候點(diǎn)錯(cuò)小數(shù)點(diǎn)了。
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Concentration Calculator
引物濃度很重要,但對(duì)于一管子未知的引物,要計(jì)算濃度可不這么簡(jiǎn)單。這個(gè)工具能在輸入260nm的光密度(在實(shí)驗(yàn)室用分光光度計(jì)測(cè)量)或OligoSpec? Calculator算出的消光系數(shù),就能算出引物濃度,這是基于每個(gè)修改和基礎(chǔ)綜合值的估計(jì)。
當(dāng)然消光系數(shù)260(ε260)用公式也能求,就是比較煩。ε260 = [(所有堿基的ε260之和) + (所有修飾的ε260)] x 0.9,所有的ε260值都以M-1?cm-1為單位。其中,dA (ε260=15,200),dC(ε260=7,050),dG(ε260=12,010),T(ε260=8400)。
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多重qPCR的光譜疊加工具
這個(gè)工具可以說(shuō)是Oligo Toolbox里最大的特色。這對(duì)于設(shè)計(jì)多重qPCR實(shí)驗(yàn)特別有用,其需要用特定熒光團(tuán)(染料)標(biāo)記的多個(gè)探針來(lái)檢測(cè)多個(gè)qPCR產(chǎn)物。基本上,不同熒光團(tuán)不能在相同的波長(zhǎng)下發(fā)射激發(fā)。
該光譜疊加工具顯示每種可用熒光團(tuán)和淬滅劑的吸收和發(fā)射光譜,允許用戶(hù)識(shí)別任何重疊。該工具還考慮了染料與正在使用的qPCR系統(tǒng)(涵蓋大多數(shù)制造商)的兼容性,因此可以為儀器找到最佳的熒光團(tuán)和淬滅劑組。
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除了工具箱之外,在這個(gè)網(wǎng)站上,還能找到其他qPCR設(shè)計(jì)軟件和一系列不斷更新的資源,包括參考論文以及所有與qPCR相關(guān)的視頻和鏈接,安利一個(gè)。