【中英文題目】

小麥抗赤霉病基因Fhb1基因，編碼帶有凝集素結(jié)構(gòu)域以及類毒素成孔結(jié)構(gòu)域的嵌合凝集素

Wheat Fhb1?encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight

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【基本信息】

期刊：NATURE GENETICS

年份：2016

IF: 32.197

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【摘要】

小麥赤霉病(FHB)是由鐮刀菌引起的，對麥類作物的破壞性極強(qiáng)，造成糧食嚴(yán)重減產(chǎn)，食用患病小麥的人畜會產(chǎn)生不良反應(yīng)。隨著FHB在美國、加拿大、歐亞以及南非的相繼爆發(fā)，FHB已經(jīng)成為全球關(guān)注的話題。在1993-2001年的美國，由于FHB造成的經(jīng)濟(jì)損失大約70.67億美元。大量研究表明，Fhb1基因是抗FHB的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，文章報道了關(guān)于中國小麥栽培種Fhb1基因的圖位克隆技術(shù)。通過進(jìn)行變異分析、基因沉默以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Fhb1基因含有類毒素成孔結(jié)構(gòu)域(PFT)，具有抗赤霉病的作用，推測PFT編碼含有兩個凝集素結(jié)構(gòu)域和一個ETX/MTX2毒素結(jié)構(gòu)域的嵌合凝集素。

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【研究思路】

取材：

取抗性和易感近同源系(R-NIL 260-1-1-2和S-NIL 260-1-1-4)用于本次基因表達(dá)研究

取Kansas State University的41個地方種和栽培種的種子用于本次研究關(guān)聯(lián)分析

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文庫構(gòu)建及測序策略：

基于Sumai 3（蘇麥3號，含有Fhb1基因位點(diǎn)的中國栽培種）構(gòu)建BAC庫，基因覆蓋度~3×，插入序列的平均長度~100 kb

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信息分析：

【研究結(jié)果】

1、對抗FHB的基因的進(jìn)一步確定

Fhb1基因來自中國栽培種Sumai 3，是重要的QTL位點(diǎn)，文章報道了Fhb1基因的定位克隆，之前已經(jīng)有研究將Fhb1基因的范圍縮小到0.08cM，兩側(cè)的DNA標(biāo)記分別為STS3B-355和STS3B-334，本研究利用了同樣的標(biāo)記物，其他標(biāo)記物來自CS（普通小麥中國春）?3BS，根據(jù)BAC末端標(biāo)記篩選Sumai 3 BAC文庫。

文章通過指紋法組裝了8個重疊的BACs，并對4個BACs(476D8, 71I24, 383G12以及572D13)進(jìn)行測序，在Fhb1附近形成兩個contigs(一共~350 kb)，之后進(jìn)一步組裝注釋。如圖1，對Sumai 3的13個基因進(jìn)行了注釋。將Sumai 3的Fhb1區(qū)域與CS的3B和3D染色體的同源區(qū)域進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Sumai 3的Fhb1區(qū)域在基因成分和長度上與3D染色體更為相似。

圖1 ?Fhb1對應(yīng)表型以及map過程 ?(a)抗性和易感的近同源系(NILs)的穗表現(xiàn)出不同的FHB表型。相比R-NIL（抗性）的穗，S-NIL（易感）的穗發(fā)生嚴(yán)重褪色；(b) S-NIL的被鐮刀霉損壞的干癟的谷粒與R-NIL飽滿健康的谷粒的比較；(c) Sumai 3中Fhb1基因在染色體上的定位；(d)染色體上經(jīng)3B 355和3B 334標(biāo)記的0.08cm區(qū)間展現(xiàn)出Fhb1基因的染色體圖譜；(e) Sumai 3中Fhb1基因的物理圖譜，包括13個開放讀碼框（箭頭表示）及其對應(yīng)位置。橙色線條表示不含基因的重復(fù)區(qū)域，將編碼蛋白的基因分別進(jìn)行標(biāo)記：MT表示tRNA甲基化轉(zhuǎn)移酶；PG表示果膠酶；NAD表示結(jié)合NAD的氧化轉(zhuǎn)移酶；NBA含有Nb-ARC結(jié)構(gòu)域；TS表示類合成酶；His表示富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白；HC表示類HCBT的防御應(yīng)答蛋白；PFT表示成孔類毒素；Sin表示sina超家族；SG表示SGNH植物酶；Cys表示胱抑素；FB含有F-box結(jié)構(gòu)域；帶星號的基因排除在Fhb1候選基因以外。(f)與CS 3DS的同源區(qū)域的比較；(g) 與CS 3BS的同源區(qū)域的比較。‘ζ’和‘ψ’分別表示基因片段和假基因；ψUDG表示假基因UDP-葡萄糖 6-脫氫酶。

為了確定抗FHB的基因，文章利用實時定量PCR對麥穗中的注釋基因進(jìn)行表達(dá)分析，對于抗性近等位基因系(R-NIL)和易感近等位基因系(S-NIL)分別注入鐮刀霉和水。PFT基因和含Nb-ARC結(jié)構(gòu)域的基因(NBA)只在R-NIL中表達(dá)，而其他基因在兩種NIL中均表達(dá)。此外，通過基因互補(bǔ)，將13個基因中的6個排除在外（圖1e），剩下的7個基因中，PFT基因和NBA基因是已知的在植物抗性中可能發(fā)揮主要作用的基因，因此，文章針對這兩個候選基因做了進(jìn)一步的基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列的預(yù)測。

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2、PFT基因的結(jié)構(gòu)及突變分析

PFT基因全長3472bp，含有兩個外顯子，最終產(chǎn)生1437bp的mRNA，cDNA末端(RACE)的隨機(jī)擴(kuò)增表明PFT轉(zhuǎn)錄本含有一個49bp的5’UTR區(qū)和216bp的3’UTR區(qū)（圖2a）；預(yù)測蛋白含有478個氨基酸，并包含了兩個凝集素結(jié)構(gòu)域和一個ETX/MTX2結(jié)構(gòu)域（圖2b）；此外，文章中利用針對誘導(dǎo)基因組局部病變(TILLING)的方法來確定PFT的候選基因。從1929個M2家系中篩選出30個突變體，突變體pft¹²⁸⁴, pft¹⁹⁵⁸,?pft¹⁴⁰⁹,?pft¹⁷⁰⁰以及?pft⁵²⁸在純合子狀態(tài)下致使作物易感FHB（圖2a），另外，圖2c可以看到，易感突變體在被感染后麥穗發(fā)生嚴(yán)重脫色，但是，HR58親本的麥穗則是健康的。除此之外，這些突變體還含有很高的脫氧雪腐鐮孢烯醇(DOH)，麥穗也表現(xiàn)出很高比例的枯萎褪色，麥粒干癟缺水（圖2d）；

圖2 PFT的基因結(jié)構(gòu)和突變分析??(a)PFT基因含有兩個外顯子（橙色框）通過一個內(nèi)含子（黑色線條）相連，兩頭的綠色框表示的是非編碼區(qū)，箭頭表示易感TILLING突變；(b)PFT蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析顯示含有兩個凝集素超家族結(jié)構(gòu)域和一個ETX/MTX2超家族結(jié)構(gòu)域，灰色框利用數(shù)字標(biāo)志了氨基酸的位置；(c)易感的TILLING突變突變體被FHB感染后表現(xiàn)出嚴(yán)重的褪色現(xiàn)象，白色箭頭指向的是接種位點(diǎn)；(d)突變體的鐮刀霉感染的谷粒與健康的抗性HR58親本的谷粒的比較。

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3、RNAi誘導(dǎo)基因沉默來驗證PFT基因的功能

RNAi可以誘導(dǎo)基因沉默，文章對小麥栽培種Bobwhite中的PFT基因做RNA干擾，該品種適合進(jìn)行轉(zhuǎn)化但是不含有Fhb1（圖3a），而含有Fhb1的Sumai 3和R-NIL則不適用于組織培養(yǎng)，因此不適合進(jìn)行轉(zhuǎn)化。圖3b可以看到，R-NIL和Bobwhite（未轉(zhuǎn)化）雜交得到的F1代植株可以抗FHB病；定量PCR結(jié)果表明，PFT的表達(dá)在R-NIL-RNAi F1代植株的麥穗中的表達(dá)比R-NIL-Bobwhite植株至少減少150倍（圖3e），Fhb1抗性株往往攜帶有PFT基因。

圖3 RNAi誘導(dǎo)基因沉默來驗證PFT基因的功能??(a)用于轉(zhuǎn)化實驗的PTF基因經(jīng)過自補(bǔ)RNAi構(gòu)建的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)經(jīng)RNAi誘導(dǎo)以及鐮刀霉交叉感染的發(fā)白的麥穗與未進(jìn)行RNAi的綠色的麥穗的比較示意圖，F(xiàn)1 R-NIL與RNAi Bobwhite雜交后麥穗嚴(yán)重褪色，易感Bobwhite和RNAi Bobwhite雜交結(jié)果也是如此，但是R-NIL與未進(jìn)行RNAi的親本雜交得到的卻是綠色的麥穗（中間），圖中黑色的點(diǎn)就是感染位點(diǎn)；(c) 經(jīng)RNAi誘導(dǎo)以及鐮刀霉交叉感染的發(fā)白的麥粒與未進(jìn)行RNAi的綠色的麥粒的比較示意圖，F1 R-NIL與RNAi Bobwhite雜交后麥粒干癟發(fā)白，但是R-NIL與未進(jìn)行RNAi的親本雜交得到的卻是健康的種子；(d)反轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)只在轉(zhuǎn)基因系中進(jìn)行RNAi（第一個膠）；PFT基因在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M中表達(dá)，但是在RNAi系中表達(dá)受到抑制（第二個膠）；肌動蛋白則證明mRNA在所有樣本中均有表達(dá)（最后一個膠）；(e)對F1植株開花前期的麥穗做定量PCR發(fā)現(xiàn)相比未進(jìn)行RNAi的樣本，進(jìn)行RNAi的樣本至少減少了150倍。

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【研究結(jié)論】

文章通過進(jìn)行變異分析、基因沉默以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Fhb1基因含有類毒素成孔結(jié)構(gòu)域(PFT)，具有抗赤霉病的作用，推測PFT編碼含有兩個凝集素結(jié)構(gòu)域和一個ETX/MTX2毒素結(jié)構(gòu)域的嵌合凝集素。

Fhb1的序列信息有利于在標(biāo)記輔助育種中涉及更好的標(biāo)記物，為FHB疾病多基因聚合和基因工程提供長遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)的解決思路。